Mga hinungdan sa pagpanghilabot sa mga reaksyon sa PCR

Atol sa reaksyon sa PCR, ang pipila ka mga hinungdan nga makabalda kanunay nga masugatan.
Tungod sa taas nga pagkasensitibo sa PCR, ang kontaminasyon giisip nga usa sa labing importante nga hinungdan nga makaapekto sa mga resulta sa PCR ug mahimong makahatag og sayop nga positibo nga mga resulta.
Parehas nga kritikal ang nagkalain-laing mga tinubdan nga mosangpot sa sayop nga negatibo nga mga resulta. Kung ang usa o daghan pang importanteng bahin sa PCR mixture o ang amplification reaction mismo mapugngan o mabalda, ang diagnostic assay mahimong mababagan. Mahimo kini nga mosangpot sa pagkunhod sa kahusayan ug bisan sa sayop nga negatibo nga mga resulta.
Gawas sa pagpugong, ang pagkawala sa integridad sa target nga nucleic acid mahimong mahitabo tungod sa mga kondisyon sa pagpadala ug/o pagtipig sa dili pa ang pag-andam sa sample. Sa partikular, ang taas nga temperatura o dili igo nga pagtipig mahimong mosangpot sa kadaot sa mga selula ug mga nucleic acid. Ang pag-ayo sa selula ug tisyu ug ang paraffin embedding nailhan nga mga hinungdan sa pagkabungkag sa DNA ug usa ka nagpadayon nga problema (tan-awa ang mga Hulagway 1 ug 2). Sa kini nga mga kaso, bisan ang labing maayo nga pagbulag ug pagputli dili makatabang.

Hulagway 1 | Epekto sa immobilisasyon sa integridad sa DNA
Ang Agarose gel electrophoresis nagpakita nga ang kalidad sa DNA nga nahimulag gikan sa mga paraffin section sa mga autopsy managlahi kaayo. Ang DNA nga adunay lain-laing average fragment lengths anaa sa mga extracts depende sa fixation method. Ang DNA napreserbar lamang kung gi-fix sa native frozen samples ug sa buffered neutral formalin. Ang paggamit sa strongly acidic Bouin fixative o unbuffered, formic acid-containing formalin miresulta sa dakong pagkawala sa DNA. Ang nahibiling fraction kay fragmented kaayo.
Sa wala, ang gitas-on sa mga tipik gipahayag sa kilobase pairs (kbp)

Hulagway 2 | Pagkawala sa integridad sa mga target sa nucleic acid
(a) Ang 3′-5′ nga gintang sa duha ka hilo moresulta sa pagkabungkag sa target nga DNA. Ang sintesis sa DNA mahitabo gihapon sa gamay nga tipik. Apan, kon ang usa ka primer annealing site walay sulod sa tipik sa DNA, ang linear amplification lang ang mahitabo. Sa labing paborableng kaso, ang mga tipik mahimong mag-resaturate sa usag usa, apan ang mga ani gamay ra ug ubos sa lebel sa detection.
(b) Ang pagkawala sa mga base, kasagaran tungod sa depurination ug thymidine dimer formation, mosangpot sa pagkunhod sa gidaghanon sa H-bonds ug pagkunhod sa Tm. Atol sa elongated warming phase, ang mga primer matunaw gikan sa matrix DNA ug dili mo-anneal bisan ubos sa dili kaayo estrikto nga mga kondisyon.
(c) Ang kasikbit nga mga base sa thymine nagporma og TT dimer.
Laing komon nga problema nga kanunay mahitabo sa mga molecular diagnostics mao ang dili kaayo maayo nga pagpagawas sa target nga nucleic acids kon itandi sa phenol-chloroform extraction. Sa grabeng mga kaso, kini mahimong nalangkit sa mga sayop nga negatibo. Daghang oras ang madaginot pinaagi sa pagpabukal sa lysis o enzymatic digestion sa mga debris sa selula, apan kini nga pamaagi kanunay nga moresulta sa ubos nga PCR sensitivity tungod sa dili igo nga pagpagawas sa nucleic acid.

Pagpugong sa kalihokan sa polymerase atol sa pagpadako

Sa kinatibuk-an, ang pagpugong gigamit isip konsepto sa sudlanan aron ihulagway ang tanang mga hinungdan nga mosangpot sa dili maayo nga mga resulta sa PCR. Sa estrikto nga biochemical nga kahulugan, ang pagpugong limitado sa kalihokan sa enzyme, i.e., kini makapakunhod o makapugong sa pagkakabig sa substrate-product pinaagi sa interaksyon sa aktibong site sa DNA polymerase o sa cofactor niini (pananglitan, Mg2+ para sa Taq DNA polymerase).
Ang mga sangkap sa sample o lain-laing mga buffer ug extract nga adunay mga reagents direktang makapugong sa enzyme o makalit-ag sa mga cofactor niini (pananglitan EDTA), sa ingon nagpa-inactivate sa polymerase ug sa baylo mosangpot sa pagkunhod o sayop nga negatibo nga mga resulta sa PCR.
Apan, daghang interaksyon tali sa mga sangkap sa reaksyon ug mga nucleic acid nga adunay target ang gitawag usab nga 'PCR inhibitors'. Kung ang integridad sa selula mabalda sa isolation ug ang nucleic acid mapagawas na, ang mga interaksyon tali sa sample ug sa naglibot nga solusyon ug solid phase mahimong mahitabo. Pananglitan, ang 'scavengers' mahimong magbugkos sa single- o double-stranded DNA pinaagi sa mga non-covalent nga interaksyon ug makabalda sa isolation ug purification pinaagi sa pagpakunhod sa gidaghanon sa mga target nga sa kadugayan makaabot sa PCR reaction vessel.
Sa kinatibuk-an, ang mga PCR inhibitor anaa sa kadaghanan sa mga pluwido sa lawas ug mga reagent nga gigamit alang sa mga klinikal nga diagnostic test (urea sa ihi, hemoglobin ug heparin sa dugo), mga suplemento sa pagkaon (mga organikong sangkap, glycogen, tambok, Ca2+ ions) ug mga sangkap sa palibot (phenols, heavy metals).

Ang mas kaylap nga mga PCR inhibitor makita sa bakterya ug eukaryotic cells, non-target DNA, DNA-binding macromolecules sa tissue matrices ug mga kagamitan sa laboratoryo sama sa gwantes ug plastik. Ang pagputli sa mga nucleic acid atol o pagkahuman sa pagkuha mao ang gipalabi nga pamaagi sa pagtangtang sa mga PCR inhibitor.
Karon, lain-laing mga automated extraction equipment ang makapuli sa daghang manual protocols, apan ang 100% recovery ug/o purification sa mga target wala pa gyud makab-ot. Ang mga potensyal nga inhibitor mahimong anaa pa sa purified nucleic acids o mahimong miepekto na. Adunay lain-laing mga estratehiya aron makunhuran ang epekto sa mga inhibitor. Ang pagpili sa angay nga polymerase mahimong adunay dakong epekto sa kalihokan sa inhibitor. Ang uban pang napamatud-an nga mga pamaagi aron makunhuran ang PCR inhibition mao ang pagdugang sa konsentrasyon sa polymerase o paggamit og mga additives sama sa BSA.
Ang pagpugong sa mga reaksyon sa PCR mahimong mapamatud-an pinaagi sa paggamit sa internal process quality control (IPC).
Kinahanglan nga mag-amping sa pagtangtang sa tanang reagents ug uban pang solusyon sa extraction kit, sama sa ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ug phenol, gikan sa nucleic acid isolate pinaagi sa hingpit nga paghugas. Depende sa ilang konsentrasyon, mahimo kini nga mo-activate o mo-inhibit sa PCR.