Mga hinungdan sa Interference sa mga reaksyon sa PCR

Atol sa reaksyon sa PCR, ang pipila nga mga hinungdan nga hinungdan kanunay nga nasugatan.
Tungod sa taas nga pagkasensitibo sa PCR, kontaminasyon giisip nga usa sa labing hinungdanon nga mga hinungdan nga nakaapekto sa mga sangputanan sa PCR ug makahimo og bakak nga positibo nga mga sangputanan.
Ang parehas nga kritikal mao ang lainlaing mga gigikanan nga nagdala sa bakak nga negatibo nga mga sangputanan. Kung ang usa o labi ka hinungdanon nga mga bahin sa sagol sa PCR o ang reaksyon sa pagpadako mismo gipugngan o nasamok, ang pagdayagnos sa assay mahimong mapugngan. Mahimo kini nga mosangput sa pagkunhod sa kaarang ug bisan ang sayup nga mga sangputanan sa negatibo.
Agi og dugang sa pagdili, ang pagkawala sa integridad nga target sa Nucleic nga mahimong mahitabo tungod sa pagpadala ug / o mga kondisyon sa pagtipig sa wala pa ang pag-andam sa sample. Sa partikular, ang taas nga temperatura o dili igo nga pagtipig mahimong mosangput sa kadaot sa mga selyula ug mga nucleic acid. Ang pag-ayo sa cell ug tisyu ug paraffin nga pag-embeding maayo nga mga hinungdan sa pagkahugno sa DNA ug usa ka makanunayon nga problema (tan-awa ang mga numero 1 ug 2). Sa kini nga mga kaso, bisan ang kamalaumon nga pagkalain ug paglimpyo dili makatabang.

Hulagway 1 | Epekto sa Immobilization sa DNA Integrity
Gipakita sa Agarose Gel Electrophoris nga ang kalidad sa DNA nga nahilayo gikan sa paraffin nga mga seksyon sa mga autopsies nga lainlain. Ang DNA sa lainlaing average nga mga gitas-on sa tipik naa sa mga extract depende sa pamaagi sa pag-ayo. Gipreserbar lamang ang DNA sa diha nga naayos sa mga lumad nga nag-awas nga mga sample ug sa buffered neyutral nga pormal. Ang paggamit sa usa ka lig-on nga acidic booin nga fixative o wala'y bayad, pormal nga sulud sa acidic nga adunay sulud nga hinungdan sa pagkawala sa DNA. Ang nahabilin nga bahin nga nabuak kaayo.
Sa wala, ang gitas-on sa mga tipik gipahayag sa mga pares sa kilobase (KBP)

Hulagway 2 | Pagkawala sa integridad sa mga target sa acid sa nucleic
(a) Ang usa ka gintang sa 3'-5 'nga gintang sa duha nga mga strands magresulta sa usa ka pahulay sa target nga DNA. Ang synthesis sa DNA mahitabo gihapon sa gamay nga tipik. Bisan pa, kung ang usa ka primer nga anningaling site nawala sa Fragment sa DNA, ang linear nga amplification ra ang nahitabo. Sa labing paborableng kaso, ang mga tipik mahimong mag-resaturate sa usag usa, apan ang mga abot gamay ra ug ubos sa lebel sa pagkakita.
. Atol sa taas nga hugna sa pag-init, ang mga primer matunaw gikan sa matrix DNA ug dili mag-ubus bisan sa dili kaayo nga mga kahimtang.
.
Ang usa pa ka sagad nga problema nga kanunay nga mahitabo sa mga Molecular Diagnostics mao ang dili kaayo-offtimal nga pagpagawas sa mga target nga nucleic acid itandi sa pagkuha sa phenol-chloroform. Sa grabe nga mga kaso, mahimo kini nga adunay kalabutan sa sayup nga mga negatibo. Daghang oras ang maluwas pinaagi sa pagpabukal sa lysis o enzymatic nga pagtunaw sa mga cell basura, apan kini nga pamaagi kanunay nga moresulta sa pagkubkob sa PCR tungod sa dili igo nga pagpagawas sa Nucleic.

Pagpili sa kalihokan sa Polymerase sa panahon sa Pagpadako

Sa kinatibuk-an, ang pagdili gigamit ingon usa ka konsepto sa sulud aron ihulagway ang tanan nga mga hinungdan nga mosangput sa mga resulta sa suboptimal nga PCR. Sa usa ka higpit nga biochemical nga kahulugan, ang pagdili limitado sa kalihokan sa enzyme, ie, kini makunhuran o nagpugong sa pag-apil sa aktibo nga lugar sa DNA Polymerase o EG, MG2 + alang sa Taq DNA POlymerase).
Ang mga sangkap sa sampol o lainlaing mga buffer ug mga extract nga adunay mga reagents mahimong direkta nga makapugong sa enzyme o lit-ag sa mga cofftors (eg Edta), sa ingon nga pag-aktibo sa polymerase ug sa dili aktibo nga mga resulta sa PCR.
Bisan pa, daghang mga interaksyon tali sa mga sangkap sa reaksyon ug mga target nga adunay mga nucleic acid nga gitudlo usab nga 'PCR inhibitor'. Sa higayon nga ang integridad sa cell nabalda sa pag-inusara ug ang nucleic acid gipagawas, ang mga interaksyon tali sa sampol ug ang kasikbit nga solusyon ug solidong hugna mahimong mahitabo. Pananglitan, ang mga scavenger 'mahimong magbugkos - o doble nga gi-stranded nga DNA pinaagi sa dili mapilit nga mga pag-apil ug makabalda sa pag-inusara ug paglimpyo pinaagi sa pagkunhod sa mga target nga sa katapusan sa PCR reaksyon.
Sa kinatibuk-an, ang mga inhibitor sa PCR naa sa kadaghanan nga mga likido sa lawas ug mga reagents nga gigamit alang sa mga klinika sa diagnostic (hemoglobin, mga sangkap sa dietaryo, cancogen, ca2 + ions)

Ang labi ka kaylap nga mga inhibitor sa PCR mahimong makit-an sa mga bakterya ug mga eukaryotic cells, dili target nga DNA, ang mga pag-ihaw sa mga makina sa tisyu sama sa mga gwantis ug plastik. Ang paglimpyo sa mga nucleic acid sa panahon o pagkahuman sa pagkuha mao ang gipalabi nga pamaagi alang sa pagtangtang sa mga inhibitor sa PCR.
Karon, ang lainlaing mga kagamitan sa pagkuha sa pag-undang mahimong mopuli sa daghang mga manual nga protocol, apan ang 100% nga pagbawi ug / o paglimpyo sa mga target wala pa nakab-ot. Ang mga potensyal nga inhibitor mahimo pa nga naa sa mga putli nga nucleic acid o tingali nahimo na. Ang lainlaing mga estratehiya adunay aron makunhuran ang epekto sa mga inhibitor. Ang pagpili sa angay nga Polymerase mahimong adunay usa ka hinungdanon nga epekto sa kalihokan sa inhibitor. Ang uban nga mga napamatud-an nga pamaagi aron makunhuran ang pagdili sa PCR mao ang pagdugang sa konsentrasyon sa polymerase o pag-apply sa mga additives sama sa BSA.
Ang pagdili sa mga reaksyon sa PCR mahimong ipakita pinaagi sa paggamit sa internal nga kalidad sa pagpugong sa kalidad (IPC).
Ang pag-atiman kinahanglan nga kuhaon aron makuha ang tanan nga mga reagents ug uban pang mga solusyon sa extraction kit, sama sa Ethanol, Cettab, SDS, SDS, SDS, SDS, SDS, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOL, SDSOPIKO ARTIOCIOC ACKOT. Depende sa ilang konsentrasyon, mahimo nila nga ma-aktibo o makapugong sa PCR.