Mga hinungdan sa pagpanghilabot sa mga reaksyon sa PCR

Atol sa reaksyon sa PCR, ang pipila ka mga makabalda nga mga hinungdan kanunay nga masugatan.
Tungod sa taas kaayo nga pagkasensitibo sa PCR, ang kontaminasyon giisip nga usa sa labing hinungdanon nga mga hinungdan nga nakaapekto sa mga resulta sa PCR ug mahimo’g makapatunghag sayup nga positibo nga mga sangputanan.
Ang parehas nga kritikal mao ang lainlaing mga gigikanan nga nagdala sa sayup nga negatibo nga mga sangputanan. Kung ang usa o labaw pa nga hinungdanon nga mga bahin sa sagol nga PCR o ang reaksyon sa amplification mismo gibabagan o nabalda, ang diagnostic assay mahimong mapugngan. Kini mahimong mosangpot sa pagkunhod sa kahusayan ug bisan sa bakak nga negatibo nga mga resulta.
Dugang sa pagdili, ang pagkawala sa target nga nucleic acid integridad mahimong mahitabo tungod sa pagpadala ug/o mga kondisyon sa pagtipig sa wala pa ang pag-andam sa sample. Sa partikular, ang taas nga temperatura o dili igo nga pagtipig mahimong mosangput sa kadaot sa mga selula ug mga nucleic acid. Ang cell ug tissue fixation ug paraffin embedding kay ilado kaayo nga mga hinungdan sa DNA fragmentation ug padayon nga problema (tan-awa ang Figures 1 ug 2). Niini nga mga kaso, bisan ang labing maayo nga pag-inusara ug pagputli dili makatabang.

Hulagway 1 | Epekto sa immobilization sa integridad sa DNA
Ang agarose gel electrophoresis nagpakita nga ang kalidad sa DNA nga nahimulag gikan sa paraffin nga mga seksyon sa mga autopsy lainlain kaayo. Ang DNA nga lainlain ang kasagaran nga gitas-on sa tipik anaa sa mga kinuha depende sa paagi sa pag-ayo. Ang DNA gipreserbar lamang kung gitakda sa lumad nga frozen nga mga sample ug sa buffered neutral formalin. Ang paggamit sa lig-on nga acidic nga Bouin fixative o unbuffered, formic acid-containing formalin miresulta sa dakong pagkawala sa DNA. Ang nahibilin nga tipik kay tipik kaayo.
Sa wala, ang gitas-on sa mga tipik gipahayag sa kilobase pairs (kbp)

Hulagway 2 | Pagkawala sa integridad sa mga target sa nucleic acid
(a) Ang 3′-5′ nga gintang sa duha ka strand moresulta sa pagkaputol sa target nga DNA. Ang synthesis sa DNA mahitabo gihapon sa gamay nga tipik. Apan, kung ang usa ka primer annealing site nawala sa DNA fragment, linear amplification ra ang mahitabo. Sa labing paborable nga kaso, ang mga tipik mahimong mag-resaturate sa usag usa, apan ang mga abot gamay ra ug ubos sa lebel sa detection.
(b) Ang pagkawala sa mga base, nag-una tungod sa depurination ug thymidine dimer formation, mosangpot sa pagkunhod sa gidaghanon sa H-bonds ug pagkunhod sa Tm. Atol sa elongated warming phase, ang mga primer matunaw gikan sa matrix DNA ug dili mag-anneal bisan ubos sa dili kaayo higpit nga mga kondisyon.
(c) Ang kasikbit nga mga base sa thymine nahimong TT dimer.
Ang laing komon nga problema nga sagad mahitabo sa molekular diagnostics mao ang dili kaayo maayo nga pagpagawas sa target nucleic acids itandi sa phenol-chloroform extraction. Sa grabe nga mga kaso, mahimo kini nga kauban sa mga sayup nga negatibo. Daghang oras ang madaginot pinaagi sa pagpabukal nga lysis o enzymatic digestion sa cell debris, apan kini nga pamaagi sagad moresulta sa ubos nga PCR sensitivity tungod sa dili igo nga pagpagawas sa nucleic acid.

Pagdili sa kalihokan sa polymerase sa panahon sa pagpadako

Sa kinatibuk-an, ang pagdili gigamit isip usa ka konsepto sa sudlanan aron ihulagway ang tanan nga mga hinungdan nga mosangpot sa suboptimal nga mga resulta sa PCR. Sa usa ka estrikto nga biochemical nga diwa, ang pagdili limitado sa kalihokan sa enzyme, ie, kini makapamenos o makapugong sa pagkakabig sa substrate-produkto pinaagi sa interaksyon sa aktibong dapit sa DNA polymerase o sa cofactor niini (pananglitan, Mg2+ para sa Taq DNA polymerase).
Ang mga sangkap sa sample o lain-laing mga buffer ug mga extract nga adunay mga reagents mahimong direktang makapugong sa enzyme o makabitik sa mga cofactor niini (eg EDTA), sa ingon dili aktibo ang polymerase ug moresulta sa pagkunhod o sayup nga negatibo nga mga resulta sa PCR.
Bisan pa, daghang mga interaksyon tali sa mga sangkap sa reaksyon ug mga nucleic acid nga adunay target ang gitudlo usab nga 'PCR inhibitors'. Sa higayon nga ang integridad sa selula mabalda pinaagi sa pag-inusara ug ang nucleic acid mapagawas, ang mga interaksyon tali sa sample ug sa naglibot nga solusyon niini ug solid nga bahin mahimong mahitabo. Pananglitan, ang 'scavengers' makagapos sa single- o double-stranded DNA pinaagi sa non-covalent interaction ug makabalda sa isolation ug purification pinaagi sa pagkunhod sa gidaghanon sa mga target nga moabot sa PCR reaction vessel.
Sa kinatibuk-an, ang mga PCR inhibitor anaa sa kadaghanan sa mga likido sa lawas ug mga reagents nga gigamit alang sa clinical diagnostic tests (urea sa ihi, hemoglobin ug heparin sa dugo), mga suplemento sa pagkaon (organic nga mga sangkap, glycogen, fat, Ca2+ ions) ug mga sangkap sa palibot (phenols). , bug-at nga metal)

Mas kaylap nga PCR inhibitors makita sa bacteria ug eukaryotic cells, non-target DNA, DNA-binding macromolecules sa tissue matrices ug laboratory equipment sama sa gloves ug plastics. Ang pagputli sa mga nucleic acid sa panahon o pagkahuman sa pagkuha mao ang gipalabi nga pamaagi sa pagtangtang sa mga PCR inhibitor.
Karon, ang lain-laing mga automated extraction equipment mahimong mopuli sa daghang manwal nga mga protocol, apan ang 100% nga pagbawi ug/o pagputli sa mga target wala pa gayud makab-ot. Ang mga potensyal nga tigpugong mahimo nga naa sa giputli nga mga nucleic acid o mahimo nga epektibo na. Adunay lainlaing mga estratehiya aron makunhuran ang epekto sa mga inhibitor. Ang pagpili sa angay nga polymerase mahimong adunay dakong epekto sa kalihokan sa tigpugong. Ang uban nga napamatud-an nga mga pamaagi aron makunhuran ang pagdili sa PCR mao ang pagdugang sa konsentrasyon sa polymerase o paggamit sa mga additives sama sa BSA.
Ang pagpugong sa mga reaksyon sa PCR mahimong ipakita pinaagi sa paggamit sa internal nga proseso sa kalidad nga kontrol (IPC).
Kinahanglang ampingan ang pagtangtang sa tanang reagents ug uban pang solusyon sa extraction kit, sama sa ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ug phenol, gikan sa nucleic acid isolate pinaagi sa hingpit nga paghugas. Depende sa ilang konsentrasyon, mahimo nilang i-activate o pugngan ang PCR.